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高等植物所含 Cyclic Peptides 研究回顧 天藥所 謝珮文 助理教授 Cyclic peptides ( Cyclopeptides )為由蛋白質或非蛋白質氨基酸之 peptide bonds 所組成之環狀化合物。第一個 cyclic peptide 為 1963 年由 Goutarel 等人自 Waltheria americana 所分離得到，至今已有超過 250 個 cyclic peptides 被分離出來，且其主要分佈於下列四個科別的植物中：番荔枝科( Annonaceae )、石竹科( Caryophyllaceae )、鼠李科 ( Rhamnaceae ) 及茜草科( Rubiaceae )。其他如菊科 ( Compositae )、唇形科 ( Labiatae )、紫金牛科 ( Myrsinaceae )、茄科 ( Solanaceae )、梧桐科 ( Sterculiaceae )、蕁麻科( Urticaceae )、馬鞭草科 ( Verbenaceae ) 及豆科 ( Leguminosae ) 等植物亦曾分離出此類化合物。以上所分離到的 cyclic peptides 一般主要可分為 heterocyclopeptides 及 homocyclopeptides 兩大類。以下分別針對其檢測方法、結構解析、與生物活性進行介紹： 在 cyclic peptide 檢測方面，由於大多數的 cyclic peptides 沒有 free 的 amino group ( NH2 ) 或 N-terminal，故無法以檢測蛋白質或氨基酸的試劑 ( ninhydrin試劑 )進行檢測。而對於部分類型的cyclic peptides，如 cyclopeptide alkaloids，則可以利用 dragendorff's 試劑來進行檢測，但此法缺乏選擇性，且容易造成誤判。故一般 cyclic peptides 之檢測還是利用水解的方式 ( 即以 6N HCl 在110℃下進行水解反應 )，再加入 ninhydrin 試劑來進行判斷。如樣品未水解前加入 ninhydrin 試劑為黃色 ( 陰性反應 )；而水解後加入 ninhydrin 試劑為紫色或藍色 ( 陽性反應 )，即表示樣品為 ( 或含 ) cyclic peptides。 除上述方式外，亦可利用 2D TLC 方法來檢測樣品中是否含有 cyclic peptides。根據大陸學者周俊 ( Zhou Jun )等人於 2000 年所發表的方法，將樣品分別於 2.5 cm × 5.0 cm 之2片 TLC 下，以CHCl3/MeOH ( 8.5/1.5或9/1 )之溶媒系統下展開。將上述其中一 TLC 片置入含有 1 ml 6N HCl 溶液之玻璃容器，並加以熔封。於110℃下反應1~2小時，取出冷卻乾燥後，再以 CHCl3/MeOH/H2O/HAc ( 7/3/0.5/4 drops )或 CHCl3/MeOH/HAc ( 8/2/2 drops )進行second dimension展開，取出乾燥後，將 TLC 噴灑上 0.2% ninhydrin 之丙酮溶液，比較兩 TLC 片 ( 未水解與水解後 )，如於水解後 TLC 片上觀察到紅紫色 ( 或藍色 )之 spots ，但於未水解之 TLC 片無紅紫色 ( 或藍色 )之 spots ，則表示樣品中具有 cyclic peptides。 Cyclic Peptides氨基酸序列 ( sequence ) 的決定與解析方面，可利用二維 NMR 光譜技術如 HMBC及 ROESY ( 或NOESY )。其中，HMBC 為利用 NH 與相鄰氨基酸上的 C=O，或 NH 與氨基酸本身之 Cα，以及相鄰氨基酸上之 Cα 間之關連 ( correalation )訊號而確定其序列；惟由於部分植物中cyclic peptides含量不高，利用 NMR 進行結構解析時，需要較長的時間，且圖譜解析度不佳，故常無法得到完整的化學結構或氨基酸序列。另外，利用質譜如 FABMS 與 ESIMS 亦是 cyclic peptides 結構解析上最常使用的。除可以探知其分子量外，FABMS 的斷裂片段在早期，更可以用來作為氨基酸序列的佐證工具。惟現今因串聯質譜儀的發展，使得 MSn 成為解決 cyclic peptides 化學結構或氨基酸序列的利器。也由於 MS 測定所需樣品量極少，故對天然物而言，更可以用來彌補 NMR 技術的不足，而可以獲得更精確的化學結構 ( 或序列 )。 Cyclic peptides 具有多方面的活性，其中包含鎮靜 ( sedative activity )、抗菌 ( antibacterial activity )、抗真菌或黴菌 ( antifungal activity )、Estrogen-like activity、D 與細胞毒活性等。以下根據其不同的生物活性進行簡介： 1. 鎮靜 ( sedative activity )作用： 有關 cyclic peptides 之鎮靜作用，最為廣泛研究者為由 Zizyphus vulgaris var. spinosus 植物 ( 酸棗仁 )中所分離得到之一系列 sanjoinines 類 cyclopeptide alkaloids 。本植物為中藥，主要為治療失眠與神經衰落等神經性疾患之藥物。 2. 抗菌 ( antibacterial activity )： Cyclopeptide alkaloids scutianines-A、B、C、E 與 mauritines-A、B、D 皆對 Gram-postive 之Bacillus subtilis 菌具有抑制作用。其中 scutianine-C 在 200 mg/ml 下可完全抑制上述細菌之生長。另rugosanines-A、B，nummularines-B、R、S與amphibine-H等則對Gram-negative之Klebsiella pneumoniae 與 Escherichia coli 菌種具有不錯的抑制活性。 3.抗真菌或黴菌 ( antifungal activity )： 在抗真菌或黴菌的活性方面，scutianines-A~E、mauritins-A~E 與 mucronines-F~H 之鹽酸鹽對於Pythuim debaryanum 具有顯著的抑制活性。另 pubescine-A 與 abyssinine C 則除了對上述 Pythuim debaryanum 具有活性外，對於 Trichoderma viride 菌株亦具有活性。此外 frangufoline、amphibine-H、rugosanine-A 與 B、以及 nummularine-B、K、R、S 則對於 Aspergillus niger 菌株則具有選擇性之抑制作用。 4.Estrogen-like activity： 根據日本學者Morita等人的研究，由中藥王不留行 ( Vaccaria segetalis ) 所分離到之 segetalins A、B、G 及 H 在劑量為 2.5 mg/ kg 下，對於 Ovariectomized rat 具有 Estrogen-like activity。 5.細胞毒及抗腫瘤活性： 在 1980 年代後期，由茜草科植物 Rubia corifolia 分離得到一系列 14-memberane 之 cyclic peptides ，根據文獻指出其具有極強的抗腫瘤活性，其中代表性化合物 deoxybouvardin ( RA-V ) 已進入 phase II 之臨床試驗。此外在最近的研究中，由石竹科植物 Stellaria yuannanensis 所分離到的yunnanins A 與 C 及由同屬植物中藥銀柴胡 ( S. dichotoma var. lanceolata ) 所分離得到之 dichotomin A~C、E、與 H~I 對於 P-388 癌細胞株具有有效之毒殺作用；而由中藥瞿麥 ( Dianthus superbus ) 中所分離到之 dianthin E ，則對於 Hep G2 癌細胞株具有選擇性之毒殺作用。 6.抗發炎活性： 在最近的研究中，由番荔枝科植物 ( Annonaceous plants ) 之釋迦 ( Annona squamosa ) 所分離到之 cyclosquamosin D 與山刺番荔枝 ( Annona montana ) 所分離到之 cyclomontanins A、C、D ，對於由 lipopolysaccharide 與 Pam3Cys 刺激下，所導致的發炎反應有抑制的作用。 7. 其他： 在其他的生物活性方面，由 Lycium chinense 中得到之 lyciumins 具有 anti-ACE 與 anti-renin 活性。由 Chassalia parvifolia 中得到之目前分子量最大的 cyclic peptides，circulin A 與 B 具有 anti-HIV活性。此外由石竹科植物菁芳草中所含 diandrine A ，則對於 collagen 所引起的血小板凝集作用，具有選擇性之抑制作用。 由上述可知， cyclic peptides 具有高度的生物與化學結構的特異性，因此近年來的研究除繼續由天然資源中獲得外，有關其合成方法與相關研究亦受到高度的重視。此外，由海洋天然產物、或由微生物獲得與高等植物截然不同之 cyclic peptides 亦為天然物研究上的新興課題。隨著近來各項活性篩檢技術，如基因晶片等方面的發展及成分分離設備的配合，相信必然可以發現更多具有活性的 cyclic peptides 。 |
