分選儀BD FACSAriaIIu
相關配備
(1) 噴嘴 (Nozzle) : 70, 85 and 100 um
(2) 收集管 (Collection devices) :
兩向分選、四向分選: 5mL Falcon tubes or 15 mL tubes
盤式分選: 6-, 12-, 24-, 48- and 96-well plate
(3) 上樣管 (Sample tube) : 5mL Falcon tubes or 15 mL tubes
檢體置備之注意事項
(a) 建議樣本濃度
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Nozzle |
Cell type |
Concentration |
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70 μm |
Lymphocytes, thymocytes or splenocytes (直徑8-12μm) |
8~12 x 106/ml |
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85 μm |
Activated lymphocytes, small cell lines (直徑12-20μm) |
7~9 x 106/ml |
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100 μm |
Large adherent cell line (直徑>20μm) |
5~8 x 106/ml |
(b) 檢體上樣前過篩
檢體或細胞樣本在分選之前需要用40 μm的篩網過濾(BD Cat. No. 352340) 或含篩網蓋試管(BD Cat. No. 352235)，過濾後細胞建議避光冰浴保存。
容易黏附的細胞，則可考慮在即將分選前再進行篩網過濾，因為冰存時間一長，細胞可能再度聚集。
Q&A
Q1. 上樣之檢體應置配在何種緩衝液裡? 可以直接懸浮在培養液裡嗎?
Ans. 不建議將細胞懸浮於medium中，因為medium中的 Phenol Red 會干擾螢光訊號，影響分選的結果，請於上機前將細胞懸浮於樣品緩衝液中。
(1) 建議的基礎配方：
1x Phosphate Buffered Saline (不含鈣、鎂離子)
1mM EDTA
25mM HEPES pH 7.0
1% Fetal Bovine Serum (Heat-Inactivated) 0.2um filter sterilize, store a 4oC
(2) 淋巴系細胞樣本緩衝液配方：
1x HBSS with 1% FBS
HBSS配方中的陽離子可增進細胞的生存力。由於這些細胞並非易於叢集細胞，配方中缺乏EDTA不成問題。
(3) 為黏附細胞設計的配方：
Raise the concentration of the EDTA to 5mM and use FBS that has been dialyzed against Ca/Mg++ free PBS。
EDTA可抑制細胞黏附。
(4) 為貼壁型細胞株設計的配方：為了完成單細胞懸浮液的準備，必須從detach步驟就開始注意。
一般先以 PBS 潤洗，再以Trypsin處理以釋放細胞，待細胞變圓(切記不可過度作用)，
便以 5 ml 含5%血清培養液收取細胞，並均勻地打散細胞懸浮液調整細胞濃度，並換成基礎樣本緩衝液配方。
(5) 為含有高比例死細胞的樣本：
基礎配方加5mM MgCl2加25~50 ug/mL DNAase I (Sigma D-4513)。這緩衝液配方將幫助減少因DNA造成的細胞聚集。
這些建議將有助於在處理樣本時，提高整個細胞族群生存能力，並在後續分選程序中提昇標靶細胞的回收率。
Q2. 分選收集管裡面需要置放buffer嗎?
Ans: 分選收集管可以事先加以coating, 提高細胞存活率 (1% BSA或 10% FBS, 4℃, overnight) 。
以 15mL 離心管收集細胞時, 一般建議先於管內加入 7~8 mL 收集液 (medium, PBS或其他溶液)。
以 5mL Falcon tube 收集細胞時, 一般建議先於管內加入 2~3 mL 收集液。
Q3. 如果分選出來的樣品要在培養，會汙染嗎?
Ans: 儀器在開關機時會進行清洗，但因為儀器所處環境仍非無菌，故通常建議帶來要接收分選產物的 Meduim 要加入抗生素，以減低污染之機率。
實驗範例
Gating strategy used to sort CD45RA+ and CD45RA- Tregs
The BD FACSAriaII system was set up for a sort using either a 70-μm or 100-μm nozzle (70 psi or 35 psi with a frequency of 87 or 60 kHz respectively). CD45RA+ Tregs and CD45RA- Tregs were sorted in purity mode at a rate of 10,000 to 11,000 events per second.
Cancer cell line side population
Human HT-29 colon cancer cells were stained with Hoechst 33342 and acquired on the BD FACSAriaIII equipped with a 375-nm laser (left dot plot). As a control, side population expression was blocked (right dot plot).